Регистрация сигнальных молекул

Регистрация сигнальных молекул

содержание

| |СТР. |

|СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ | |

|ВВЕДЕНИЕ | |

|1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ | |

|1.1. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ TI-ПЛАЗМИД АГРОБАКТЕРИЙ В ГЕНЕТИчЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ | |

|1.1.1. КРАТКАя ХАРАКТЕРИСТИКА AGROBACTERIUM TUMEFACIENS | |

|1.1.2. CОЗДАНИЕ ВЕКТОРОВ НА ОСНОВЕ TI-ПЛАЗМИД | |

|1.1.3. ПРОЦЕССИНГ ТДНК В БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКЕ | |

|и ее перенос в клетки растений | |

|1.1.4. Разработка система трансформаций растений с | |

|помощью Agrobacterium tumefaciens | |

|1.1.5. Проблема сохранения чужеродных генов, | |

|перенесенных в растение | |

|1.1.6. Анализ экспрессии чужеродных генов в трансформированных | |

|растениях | |

|1.2. Использование метода генетической | |

|инженерии для трансформации однодольных растений | |

|1.2.1. Краткие характеристики ряски | |

|1.3. Сигнальные молекулы, их способность индуцировать процессинг | |

|тДНК | |

|2. Материалы и методы | |

|2.1. Материалы | |

|2.1.1. Оборудование | |

|2.1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды | |

|2.1.3. Растения | |

|2.1.4. Среды микробиологические для | |

|культивирования растений | |

|2.1.5. Другие растворы | |

|2.1.6. Ферменты, используемые в генной инженерии | |

|2.1.7. Антибиотики | |

|2.2. Методы | |

|2.2.1. Инкубация Agrobacterium tumefaciens с | |

|экссудатами тканей растений | |

|2.2.2. Выделение тотальной ДНК Agrobacterium tumefaciens | |

|2.2.3. Блод-гибридизация тДНК по Саузерну | |

|2.2.4. Трансформация клеток Esherichia coli | |

|3. результаты | |

|4. обсуждение | |

|5. выводы | |

литературы | | |приложение | | |

СПИСОК СОкРАЩЕНИЙ

НУК – нафтиуксусная кислота

БАП – бензиламинопурин

MS –

LB –

тДНК –

Ар – ампицилин

Cs – цефотоксин

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы:

Свойство бактерий вида Agrobacterium tumefaciens вызывать у растений

корончато-галловую болезнь связано с присутствием в их клетках крупных (95-

156 мДа) конъюгированных Ti-плазмид (от англ. tumor-inducing – вызывающий

опухоль). В процессе идентифицирования растений часть генетического

материала Ti-плазмид – тДНК (от англ. transferred DNA – передаваемая)

перемещается в растительные клетки и интегрируется в хромосомы, оставаясь

частью наследственного материала. Гены тДНК экспрессируются в

трансформарованных растительных клетках, нарушают их фитогормональный

баланс и определяют синтез специфических ------- соединений.

Таким образом, агробактерии являются природными "генными инженерами",

осуществляющий поразительный по филогенетической дальности перенос

генетической информации. На основе агробактерий сконструированы эффективные

векторные системы для генетической инженерии растений.

Агробактириальная трансформация происходит в результате сложного процесса

взаимодействия между бактериальными и растительными клетками. В этом

процессе одной из решающих стадий является рецепция агробактериями особых

сигнальных молекул, присутствующих в экссудатах поврежденных тканей

растений. Сигнальные молекулы индуцируют экспрессию генов области vir

(агробактериальных Ti-плазмид), контролирующих вырезание тДНК и ее перенос

в клетки растений. Агробактерильная трансформация наблюдается у широкого

круга голосеменных и двудольных растений, однако, она отмечена лишь у

весьма незначительного числа однодольных растений. Одной из причин

ограничений агробактериальной трансформации однодольных считается

присутствие в их клетках сигнальных молекул, индуцирующих процессинг и

перенос тДНК.

Цель работы:

В настоящее время имеются противоречивые данные относительно наличия таких

сигнальных молекул у однодольных растений. В связи с этим, целью данной

работы был анализ ряски на присутствие у них сигнальных молекул,

индуцирующих процессинг тДНК.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Использование Ti-плазмид агробактерий в генетической инженерии

растений

1.1.1. Краткая характеристика Agrobacterium tumefaciens

За последнее десятилетие в области генетической инженерии растений

достигнуты значительные успехи. Были разработаны разнообразные методы

генетической трансформации и, в настоящее время осуществлена экспрессия

чужеродных генов в растениях многих видов. Наиболее важным для развития

генетической инженерии растений было открытие молекулярных основ опухолевых

образований с помощью Agrobacterium tumefaciens [7].

Вирулентные штаммы Agrobacterium tumefaciens (сем. Rirobiaceae)

характеризуются присутствием в клетках большой плазмиды, так называемой Ti-

плазмиды, весом более 150 т.п.н. (см. Приложение) [9].

Агробактерии вызывают опухолевый рост у многих двудольных и голосеменных, а

так же у некоторых однодольных растений [2,3]. Для инфицирования in vivo

необходимо повреждение тканей растения [12].

После прикрепления к клеточной стенке растительной клетки агробактерии

переносят часть Ti-плазмиды (так называемой тДНК) в ядро, где происходит ее

стабильная интеграция в хромосому растения.

Доказано, что функция распознавания клеток и прикрепления к ним, а так же

вырезание, перенос и, возможно, интеграция тДНК в растительный геном

кодируется двумя хромосомными генами – Chva и Chvb [13] и рядом генов vir-

области, находящихся на Ti-плазмиде [14].

После переноса в ядро растительной клетки, тДНК может интегрировать в геном

в виде одной или нескольких копий [15]. Встроенная тДНК имеет свойства,

характерные для ДНК эукариот, что показано в экспериментах по

гиперчувствительности к ДНК-азе I (Schafer, 1984). В зависимости от типа Ti-

плазмиды, в тДНК находится от семи до тринадцати генов, ответственных за

опухолевый фенотип. Гены 1 и 2 кодируют ферменты, участвующие в синтезе

ауксина, индолилуксусной кислоты, в то время, как ген 4 кодирует

изопентенилтрансферазу, синтезирующую цитокинин изопентенила денозин 5'-

монофосфат [16].

Одновременная транскрипция генов 1,2 и 4 приводит к повышению уровня

фитогормонов внутри трансформированных клеток. Результатом этого является

повышение митотической активности и образование опухоли. Другие гены тДНК

кодируют синтез так называемых опинов, из которых наиболее изучены нопапин

и октопин. Опины представляет собой производное аминокислот и сахаров,

которые служат источником питания для агробактерий [14]. В целом,

образование корончатого галла представляет собой хорошо охарактеризованный

пример генетической инженерии растений в природе.

Мутации в вирулентных генах агробактерий. Наличие Ti-плазмид в клетках

агробактерий является абсолютно необходимым условием патогенности

микроорганизма. Излеченные от Ti-плазмид штаммы агробактерий авирулентны.

На вирулентность Agrobacterium tumefaciens оказывают влияние различные

мутации, картируемые как на опухолевых плазмидах, так и на хромосомах.

Ранние этапы взаимодействия агробактерий с растениями, так же как

хемотаксис, прикрепление к поверхности растительной клетки и специфическое

связывание в центрах инфекции контролируются генами, имеющими хромосомную

локализацию. В хромосоме расположены некоторые гены, регулирующие

экспрессию vir-генов Ti-плазмид [19]. Присоединение агробактерий к клеткам

растения является одним из первых этапов, определяющих эффективное

взаимодействие. Этот этап у Agrobacterium tumefaciens контролируют два

связанных между собой хромосомных локуса Chva и Chvb, размерами 1,5 kb и

5kb, соответственно [Дуглас и др, 1985]. Гены этих локусов экспрессируются

конститутивно. В результате транспозонного мутагенеза этих областей

получают авирулентные или дефекнтые по прикреплению агробактерии. Мутации

в этих локусах сильно понижают или ингибируют вирулентность бактерии, но не

для всех хозяев. Локус Chvb определяет синтез нейтрального циклического (-D-

гликана, который трансформируется в периплазматическое пространство клетки

с помощью продукта гена Chva. Роль нейтрального (-D-гликана в инфекционном

процессе еще точно не установлена. Помимо циклического (-D-гликана в

прикреплении патогенных агробактерий к растительным клеткам принимают

участие и другие полисахариды, в частности внеклеточные экзополисахариды.

Организация vir-генов Ti-плазмид. Вирулентные гены агробактерий на Ti- и

Ri-плазмидах кластеризованы в области vir разметом около 30-35 kb,

проявляющей в этих плазмидах значительную гомологию ДНК. Выявлена также

гомология vir-генов Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens с tra-генами

конъюгитивных плазмид. В ----- Ti-плазмидах в области vir локализовано

шесть различных групп комплементации A, B, C, D, E и G, организованных в

единый регулон [Stachel Nester, 1986]. Октопиновая Ti-плазмида Arh 5 имеет

дополнительный локус vir F, расположенный справа от локуса vir E [Kooykaas

et al., 1984]. Мутации в генах и --------- vir A, vir G, vir B и vir D

придают агробактериям авирулентный фенотип, в отличие от большинства

хромосомных мутаций, имеющих круг трансформируемых растений-хозяев.

Продукты генов vir-области контролируют процессинг тДНК в бактериальной

клетке, ее перенос в растительную клетку и интеграцию в ядерный геном

растения, причем эти процессы гены vir могут определять не только в цис, но

и в транс положении по отношению к тДНК (то есть находясь в разных

репликонах). Исходя из этого свойства области vir, сконструированы и

успешно используются в практике удобные бинарные векторы для генетической

инженерии растений [Дрейпер с соавт, 1991]. Для процессов "вырезания" тДНК

из плазмиды (точнее, высвобождения в процессе репликативного синтеза) и ее

переноса в растение необходимо фланкирование этой области особыми

границами: несовершенными прямыми повторяющимися последовательностями ДНК

размером 24 ---- , проявляющими значительную гомологию у всех изученных Ti-

и Ri-плазмид. Границы тДНК гомологичны области oriT конъюгативных плазмид.

В этой области сайт-специфические эндонуклеазы производят одноцепочечный

разрыв, служащий началом репликации по типу разматывающегося рулона,

происходящей в процессе транспорта плазмиды. Репликация обеспечивает

сохранение плазмиды в материнской клетке и появление ее копии в дочерней.

Для нормального процессинга тДНК и ее переноса в растительную клетку

особенно важна ее правая граница, которая одна может определять полярность

переноса тДНК. Удаление правой границы из Ti-плазмид делает агробактерии

полностью авирулентными. Замена ее на искусственно синтезированную, так же

как и на левую, восстанавливает вирулентность микроорганизма.

На процессинг тДНК в клетках бактерий влияют мутации в генах vir D, vir C и

vir E – оперонов, на транспорт т-комплекса в растительную клетку – мутации

в генах vir B и vir D – оперонов.

1.1.2. Создание векторов на основе Ti-плазмид

В начале восьмидесятых годов были сделаны первые попытки перенести

чужеродные последовательности ДНК в растительные клетки либо с помощью

транспозонного мутагенеза [Uernals-teens et al., 1980], либо путем сайт-

специфической миграции генов в тДНК и последующей двойной рекомбинацией с

Ti-плазмидой дикого типа [Matrke et al., 1981; leemans et al., 1981].

Однако, эти ранние эксперименты, основанные на двойной рекомбинации,

занимали много времени, были довольно сложны и трансформации проходили с

очень низкой частотой. Необходимо было разработать более эффективные

векторы, чтобы облегчить генетические манипуляции с бактериями и позволить

селекцию и регенерацию трансформатов.

Сейчас используют две принципиально разные системы для введения чужеродных

генов в растения с помощью Ti-плазмид:

---- векторы

бинарные векторы.

В основе создания -------- векторов лежит тот факт, что гены тДНК не -------

для растительных клеток, и любая последовтельность ДНК, встроенная между

границами тДНК, может интегрировать в хромосому растительной клетки и

нормально там экспрессироваться [Zambryski et al., 1983]. В --------

векторых системах тДНК можно заменить, например, на последовательность

pBR322, а чужеродную ДНК, которую предполагается перенести в растения,

нужно проклонировать в этом же векторе.

Затем путем гомологичной рекомбинации эта чужеродная ДНК может быть

перенесена на Ti-плазмиду реципиентного штамма агробактерии (рис. 2). Одним

из первых таких векторов на основании Ti-плазмид авляется pGV3850

[Zambryski et al., 1983]. В нем все гены, ответственные за синтез

фитогормонов, были заменены на последовательность pBR322.

ДНК pBR322 обеспечивала гомологию для ------- области тДНК pGV3850 с любыми

производыми pBR, несущими клонированный ген.

Гены, кодирующие различные маркерные белки для быстрого отбора трансгенных

растений, были встроены в pGV3850 [De Blocle, 1984]. Была разработана

система трехродительного скрещивания для переноса любых производных pBR322

из E. coli в A. tumefaciens pGV3850 [Van Haute et al., 1983]. В настоящее

время сконструированы и успешно используются и другие --- ----------

векторы на основе Ti-плазмид [Royers et al., 1988].

Рис. 2.

Схемы -------- (А) и бинарной (Б) векторных систем. vir – область

вирулентности. HOM – области гомологии, в пределах которых может

происходить рекомбинация, приводящая к образованию коинтегратов. LB и RB –

левая и правая границы тДНК. MCS - ----- сайт для клонирования. РТМ –

маркет трансформации для растений. RES – маркер устойчивости к антибиотику

для бактерий. OriT – начало переноса и bom-сайт для мобилизации векторов

при конъюгации. Col E1 – начало репликации из плазмиды Col E1. RK2 – начало

репликации из плазмиды широкого круга хозяев RK2.

Система бинарных векторов основана на том, что область тДНК и гены vir

могут распологаться на разных плазмидах [Hockemu et al., 1983]. В таких

системах обычно присутствуют два элемента:

Ti-плазмида-помощник, в которой тДНК польностью делетирована. Эта плазмида

несет в своем составе гены vir, действующие in trans.

Плазмида широкого круга хозяев, имеющая сайты для клонирования и маркерные

гены для селекции растений, ограниченные правой и левой фланкирующими

последовательностями тДНК [An et al., 1988] рис

Обе описанные выше системы векторов предполагают --------- этапах сборку

нужных конструкций в промежуточных векторах, например в pAP2034 [Veltena,

Sehell., 1987] или pRT103 [Topter et al., 1983] а затем перенос из в

готовом виде в рецепиентные штаммы агробактерий.

1.1.3. Процессинг тДНК в бактериальной клетке

и ее перенос в клетки растений

Формы процессированной тДНК. При культивировании Agrobacterium tumefaciens

с механически поврежденными частями растений, регенерирующими протопластами

или в присутствии --------- из клеток бактерий можно выделить различные

молекулярные формы процессированной тДНК – одноцепочечные линейные,

двуцепочечные линейные и двуцепочечные кольцевые, которые могут

претендовать на роль посредника в переносе генетического материала в

растительную клетку [-------, 1980]. Причем кольцевая форма, образующаяся

за счет гомологичной рекомбинации между правой и левой границей тДНК с

образованием одной гибридной границы, встречается в очень малых

количествах. При ее образовании не происходит репликативного синтеза ДНК, в

то время как в случае образования двух других форм, возможно прохождение

репликации тДНК в бактериах в процессе ее транспотра в растения (к

появлению одноцепочечных форм может приводить прерывание, ингибирование

прерывистого синтеза запаздывающей цепи). Репликация призвана обеспечить

сохранение тДНК в исходной Ti-плазмиде, если только не допустить

возможность существования физического вырезания материала тДНК из Ti-

плазмид за счет образования двухцепочечных разрывов в границах.

Исчезновение тДНК из Ti-плазмид является главным недостатком отошедшей на

второй план подобной "эксцезионной модели". Тем не менее, образование

двуцепочечных разрывов внутри границ и появление детектируемых количеств

линейной двуцепочечной формы тДНК при культивировании бактериальных клеток

в присутствии ---------- исследователи наблюдали уже через 30 минут после

добавления этого индуктора в среду. Так же в условиях индукции vir-генов ---

------ в клетках агробактерий обнаруживается линейная одноцепочечная форма

процессированной тДНК [Stachel et al., 1986].

Появление этого интермедиата обнаруживается через восемь часов после

добавления индуктора, и его количество накапливается на протяжении

последующих 40 часов более, чем в два раза, а затем идет на убыль,

показывая, что процесс лимитирован.

Какая из форм транслоцируется через бактериальную мембрану в бактериальную

клетку до сих пор остается не выясненным из-за трудности определения

относительного количества каждой из форм и выявления динамики их

превращения. Возможно, процессинг и транспорт тДНК не разобщены во времени

и идут сопряженно подобно конъюгационному переносу плазмид, происходящему в

месте контакта мембран конъюгирующих клеток [Clark and Warren, 1979]. Тогда

все обнаруживаемые интермедиаты могут быть аберрантными формами прерванного

на каком-то этапе неделимого процесса (или неправильно завершенного). В

случае индуцированной экспрессии vir-генов ------- отсутствует главный

элемент взаимодействия – контакт бактериальной клетки и растительной

клетки, и, поэтому, все обнаруживаемые в этом случае формы могут

претендовать на роль посредника лишь с определенными допущениями.

Достоверно известно, что в растительную клетку попадает только одна цепь

тДНК и конвертируется в двуцепочечную уже в растительной клетке.

Обсуждается, что в случае прохождения в клетке Agrobacterium tumefaciens ---

----- полуконсервативной репликации тДНК вторая цепь может в процессе

переноса гидролизоваться, высвобождая энергию для транспорта переносимой

цепи.

1.1.4. Разработка система трансформаций растений с

помощью Agrobacterium tumefaciens

Большинство первоначальных экспериметнов по генетической трансформации

растений было предпринято с помощью заражения пораненных растительных

клеток с помощью агробактерий с немодифицированными Ti-плазмидами. Для

сохранения стерильности часто инфицировали эксплантаты in vitro вместо

целых растений. Бактерии затем удаляли, добавляли в среду цефотоксин или

карбенициллин. Трансформанты отбирали на безгормональной среде.

В дальнейшем по мере создания обезоруженных векторов и новых селективных

маркеров, был разработан более эффективный метод, дающий большое число

трансформантов: кокультивирование агробактерий с растительными

протопластами либо с эксплантантами листьев. Было показано, что

кокультивирование протопластов с агробактериями, либо с бактериальными -----

---, приводит к образованию опухоли [Marton et al., 1979, Wullems et al.,

1981]. Затем подобный подход был успешно применен для трансформации

растительных клеток агробактериями, несущими в составе тДНК химерные

селективные маркеры [Fraley et al., 1983, Herrera-Estrella et al., 1983].

Этот метод был в дальнейшем улучшен использованием так называемых фидерных

культур [Fraley et al., 1983]. Однако, все перечисленные методы пригодны

только для трансформации растений, которые можно легко регенерировать из

протопластов (например, табак и петуния). Эту проблему мрожно легко

преодолеть кокультивируя агробактерии с листовыми дисками вместо

протопластов [Horch et al., 1985; Rogers et al., 1986; Lloyd et al., 1986].

Стерильные листовые диски --------- с агробактериями, несущими в составе

обезоруженного вектора какой-либо селективный маркер устойчивости к

антибиотику. Затем кусочки листьев культивируют два дня на фидерных чашках

со средой для образования побегов. После этого их переносят на среду с

Страницы: 1, 2