Влияние циано- и тетразольных производных цитозина и тимина на резистентность эритроцитов

эритрограмм.

Исследовали свойства соединений, имеющие следующее химическое

строение:

Наблюдения проводили in vivo. Было поставлено две серии экспериментов,

в которых использовали 36 нелинейных крыс весом 200-250г. В каждой серии

были сформированы две опытные и одна контрольная группа.

В первой серии опытов крысам одной опытной группы пятикратно

внутрибрюшинно с интервалом в 48 часов вводили по 1 мл раствора цитозина в

разовой дозе 1 мг/100 г массы животного, другой группы раствор

цианоцитозина в той же дозе таким образом, что суммарная доза вводимого

вещества в обеих группах составила 5 мг на 100 г массы животного. Во второй

серии опытов в аналогичных условиях особями одной опытной группы

инъецировали цитозинтетразол, другой – тиминтетразол.Крысам обеих

контрольных групп вводили физиологический раствор в равном объеме.

Кровь для анализа брали в утренние часы перед кормлением животных из

кончика хвоста до начала введения растворов исследуемых веществ – исходные

значения, через 2,5 и 24 часа после каждого введения, а затем на 3, 5, 7 и

14 сутки после окончания инъекций. Для проведения исследования 20 мкл крови

смешивали с 20 мл физиологического раствора, получая таким образом взвесь

эритроцитов в разведении 1:1000.

Все исследования проводились при комнатной температуре.

Измерения оптической плотности взвеси эритроцитов производили на

фотоэлектроколориметре КФК-2 УХЛ 42 при красном светофильтре. В кювету

рабочей ширины 10 мм вливали 2 мл взвеси эритроцитов из отдельной пробы и

добавляли к ней в качестве гемолитика 2 мл 0,004 н HCl. После этого кювету

помещали в кюветодержатель прибора. С момента введения во взвесь

эритроцитов гемолитика величина светопропускания исследуемого раствора

начинала изменятся в связи с разрушением клеток крови. Каждые 30 секунд

отмечали показания прибора по шкале экстинкции (Ео). Измерение вели до

получения двух совпадающих показаний, т.е. до завершения гемолиза (Еn). В

результате получали ряд убывающих экстинкций, каждая из которых

соответствовала степени гемолиза к моменту отсчета. По значениям оптической

плотности вычисляли процент разрушенных эритроцитов за каждые 30 секунд,

принимая разность Ео-Еn за 100%.

Уровень значимости различий определяли по таблице стандартных значений

критерия Стьюдента.

2.2. Результаты исследования

2.2.1. Влияние цитозина на резистентность эритроцитов

Результаты проведенных исследований показали, что цитозин при

многократных введениях животным не оказал существенного влияния на исходные

качественные характеристики эритроцитов. Об этом позволяют судить данные

таблиц 1 и 2 (Приложение), в которых представлены усредненные показатели

оптической плотности взвесей разрушающихся в ходе гемолиза эритроцитов

особей опытной и контрольной группы. Как видно из таблиц, в отдельные сроки

в течение длительного периода наблюдений имели место колебания

функционального состояния эритроцитов по сравнению с исходным уровнем у

животных обеих групп. Обращает на себя внимание идентичный характер и

незначительные пределы сдвигов показателей у контрольных и подопытных

особей.

О физико-химическом состоянии эритроцитов, подвергшихся воздействию

гемолитика, до и на фоне введения животным цитозина позволяют судить

кислотные эритрограммы (рис. 2.1, 2.2).

Первоначальное распределение по степеням стойкости к гемолитику

эритроцитов интактных крыс отражает исходная эритрограмма. Согласно

графику, процесс разрушения эритроцитов начинается через 1,5 минуты после

добавления к их взвеси гемолитика, наибольшей интенсивности достигает к 3,5

минутам и заканчивается через 7,5 минут.

Как известно, состав эритроцитарной популяции неоднороден. В

соответствии с хронологическим возрастом эритроцитов положение начальной

части кривой определяется содержанием в периферической крови старых

малостойких клеточных форм, средней части – основной массы среднеустойчивых

клеток, и ее конечной части – наличием устойчивых молодых форменных

элементов [20, 38].

Рис. 2.1. Кислотные эритрограммы крови крыс на фоне пятикратного

введения цитозина в разовой дозе 1 мг/100 г массы

1-5 – последовательность введения

исходная гистограмма

через 2,5 часа

через 24 часа

Рис. 2.2 Кислотные эритрограммы крови крыс в отставленные сроки

наблюдения после пятикратного введения цитозина

1-4 – на 3, 5, 7 и 14 сутки соответственно

исходная гистограмма

опытная кривая

Рис. 2.3 Кинетика гемолиза крови крыс на фоне пятикратного введения

цитозина в разовой дозе 1 мг/100 г массы

1-5 – последовательность введения

исходная гистограмма

через 2,5 часа

через 24 часа

Рис. 2.4. Кинетика гемолиза эритроцитов крыс на фоне пятикратного

введения цитозина в разовой дозе 1 мг/100 г массы

1-4 – на 3, 5, 7 и 14 сутки соответственно

исходная гистограмма

после окончания введений веществ

Анализ эритрограмм на фоне пятикратного введения животным цитозина не

выявил заметного перераспределения эритроцитов по степени их устойчивости к

дезинтегрирующему агенту. Во все сроки наблюдения интенсивность их

разрушения под действием соляной кислоты и общая продолжительность лизиса

мало различались с их исходными показателями и почти полностью совпадали с

таковыми у контрольной группы.

Отсутствие выраженного эффекта действия цитозина на резистентность

эритроцитов отражают также кривые кинетики гемолиза, которые характеризуют

динамику разрушения клеток крови под влиянием гемолитика (рис.2.3, 2.4).

Кривая процесса гемолиза у интактных крыс характеризуется S-образной

формой. Она медленно нарастает в своей начальной части, затем круто

поднимается вверх в интервале от 2,5 до 5,5 минут, после чего переходит в

плато и заканчивается на 7,5 минуте.

Как видно из приведенных графических материалов, на фоне пятикратного

введения растворов пиримидина и в течении двух недель после прекращения

инъекций форма кривой практически не отличается от исходных характеристик.

2.2.2. Влияние цианоцитозина на резистентность эритроцитов

В серии опытов с многократным введением животным цианоцитозина

выявлена способность последнего определенным образом изменять базовые

свойства эритроцитов. Усредненные данные по динамике показателей оптической

плотности взвесей разрушающихся эритроцитов у животных этой группы

представлены в таблице 3 (Приложение). Сравнительный анализ исследований

крови опытных и контрольных особей показали, что циановое производное

пиримидинового основания оказало заметное влияние на функциональное

состояние эритроцитов. При относительно слабых колебаниях устойчивости к

гемолитику форменных элементов крови контрольных крыс, которым длительное

время инъекцировали физиологичес-

Рис. 2.5. Кислотные эритрограммы крови крыс на фоне пятикратного

введения цианоцитозина в разовой дозе 1 мг/100 г массы

1-5 – последовательность введения

исходная гистограмма

через 2,5 часа

через 24 часа

Рис.2.6. Кислотные эритрограммы крови крыс в отставленные сроки

наблюдения после пятикратного введения цианоцитозина

1-4 – на 3, 5, 7 и 14 сутки

исходная кривая

опытная кривая

кий раствор, отмечены достаточно выраженное и закономерное усиление

резистентности эритроцитов, обусловленное влияние цианоцитозина. Динамику

качественных изменений клеток крови под влиянием исследуемого вещества

позволяют проследить кислотные эритрограммы на рис.2.5, 2.6.

Как видно из эритрограмм, смена их положений относительно

первоначального указывает на тенденцию к усилению устойчивости эритроцитов

к гемолитику. Это находит отражение в сдвиге эритрограмм в сторону больших

временных значений. Уже на фоне первых трех инъекций растворов

цианоцитозина вершина кривой смещается с 3,5 до 4,0-х минут, а при

последующих введениях до 5,0 минут (p<0,05), а конец эритрограммы с 7,5 до

8,0 минут. Это означает, что скорость распада клеток крови под влиянием

соляной кислоты несколько замедляется, и время от начала до полного

завершения химического гемолиза удлииняется. Эффект оказывается достаточно

стойким и сохраняется в течение недели послеокончания введений вещества.

Лишь к концу второй недели резистентность эритроцитов приближается, однако

не возвращается полностью к исходному уровню.

Кривые кинетики гемолиза показательны в плане описания скорости

процесса лизиса гемолитиком эритроцитов подопытных животных (рис.2.7, 2.8).

На фоне первого и всех последующих инъекций растворов исследуемого вещества

форма кривой относительно исходной существенным образом изменяется:

становится более пологой и вся кривая смещается вправо. После четвертого и

пятого введений с высокой степенью достоверности наблюдается отклонение

кривых по всем характеристикам в область больших временных значений, что

свидетельствует об увеличении времени контакта эритроцитов до момента их

разрушения соляной кислотой.

Рис. 2.7. Кинетика гемолиза крови крыс на фоне пятикратного введения

цианоцитозина в разовой дозе 1 мг/100 г массы

1-5 – последовательность введения

исходная кривая

через 2,5 часа

через 24 часа

Рис. 2.8. Кинетика гемолиза эритроцитов крыс на фоне пятикратного

введения цианоцитозина в разовой дозе 1 мг/100 г массы

1-4 – на 3, 5, 7 и 14 сутки соответственно

исходная гистограмма

после окончания введений веществ

В отставленные сроки тенденция к усилению сопротивляемости клеток к

действию гемолитика сохраняется, однако выраженность эффекта уменьшается.

2.2.3. Влияние цитозинтетразола на резистентность эритроцитов

При исследовании крови животных, которым пятикратно вводили раствор

цитозинтетразола было отмечено качественно иное изменение базовых физико-

химических свойств эритроцитов. Усредненные данные по изменению показателей

оптической плотности взвесей разрушающихся клеток крови соляной кислотой

представлены в таблице 4 (Приложение). Изменение резистентности форменных

элементов также иллюстрируют кислотные эритрограммы и кривые кинетики

гемолиза (рис.2.9-2.12).

Согласно представленным материалам, под влиянием цитозинтетразола

устойчивость эритроцитов существенным образом ослабилась. Тенденция к

снижению способности клеток красной крови противостоять действию гемолитика

обнаружилась уже на фоне первой инъекции тетразольного производного. Эффект

нарастал с кратностью введений вещества (рис.2.9). После третьей инъекции

ускорение процесса разрушения эритроцитов под действием соляной кислоты

выразилось в сдвиге вершины кривой с 5.5 на 4,5 минуты (p<0,05) и смещение

всей площади эритрограммы влево. Обращает на себя внимание некоторе

расширение основания кривой, что означает удлинение общего времени

гемолиза. После третьего и последующих введений оно увеличилось по

сравнению с первоначальным на одну минуту, о чем свидетельствует смещение

конца эритрограммы с 7 до 8 минут. Выраженность эффекта сохраняется не

только до последнего введения вещества, но и в отставленные сроки

наблюдений.

Способность цитозинтетразола понижать резистентность эритроцитов

отражают также кривые кинетики гемолиза (рис.2.11, 2.12). Относительно

исходного положения последующие кривые процесса гемолиза имеют более

Рис. 2.9. Кислотные эритрограммы крови крыс на фоне пятикратного

введения цитозинтетразола в разовой дозе 1 мг/100 г массы

1-5 – последовательность введения

исходная гистограмма

через 2,5 часа

через 24 часа

Рис.2.10. Кислотные эритрограммы крови крыс в отставленные сроки

наблюдения после пятикратного введения цитозинтетразола.

1-4 – на 3, 5, 7 и 14 сутки

исходная кривая

опытная кривая

Рис. 2.11. Кинетика гемолиза крови крыс на фоне пятикратного введения

цитозинтетразола в разовой дозе 1 мг/100 г массы

1-5 – последовательность введения

Рис. 2.12. Кинетика гемолиза крови крыс на фоне пятикратного введения

цитозинтетразола в разовой дозе 1 мг/100 г массы

1-4 – на 3, 5, 7 и 14 сутки соответственно

исходная кривая

после окончания введений веществ

крутую форму и сдвигаются влево. Как видно из графиков, начальный участок,

соответствующий наличию в популяции эритроцитов малостойких клеточных форм,

у интактных крыс находился в интервале от 1,5 до 4.5 минут, а уже после

третьего введения сдвигался до 3.5 минут. Как этот факт, так и более

быстрое разрушение остаточной части эритроцитов в пробе, свидетельствуют о

повышении в периферической крови количества мало- и среднестойких форменных

элементов. Так до начала введений подопытным животным цитозинтетразола под

влиянием соляной кислоты в пробе разрушились через 4.0 минуты 9%, а через

5.5 минут 66% эритроцитов. В пробах крови крыс сразу после третьего

введения химического агента гемолитика вызывали разрушение на те же сроки

уже 27 и 92% соответственно.

После прекращения инъекций цитозинтетразола функциональное состояние

эритроцитов не восстанавливалось до конца проводимого исследования.

2.2.4. Влияние тиминтетразола на резистентность эритроцитов

В серии опытов с многократным введением животным тиминтетразола был

получен аналогично рассмотренному у цитозинтетразола эффект ослабления

резистентности (таблица 5, рис.2.13, 2.14).

Как иллюстрируют гистограммы, уже через 2.5 часа после первого

введения исследуемого соединения наблюдалось смещение площади кривой в

область меньших временных значений.

При последующих введений растворов вещества эффект усиливается

вследствие перераспределения эритроцитов по степени стойкости к гемолитику.

Максимум эритрограммы смещается с 5,5 на 4.5 минут.

Кривые гемолиза подтверждают полученный эффект снижения устойчивости

эритроцитов после инъекций тиминтетразола (рис.2.15, 2.16). На протяжении

всего периода введений вещества, а также в отставленные

Рис. 2.13. Кислотные эритрограммы крови крыс на фоне пятикратного

введения тиминтетразола в разовой дозе 1 мг/100 г массы

1-5 – последовательность введения

исходная гистограмма

через 2,5 часа

через 24 часа

Рис.2.14. Кислотные эритрограммы крови крыс в отставленные сроки

наблюдения после пятикратного введения тиминтетразола.

1-4 – на 3, 5, 7 и 14 сутки

исходная кривая

опытная кривая

Рис. 2.15. Кинетика гемолиза эритроцитов крыс на фоне пятикратного

введения тиминтетразола в разовой дозе 1 мг/100 г массы

1-5 – последовательность введения

исходная гистограмма

через 2,5 часа

через 24 часа

Рис. 2.16. Кинетика гемолиза эритроцитов крыс на фоне пятикратного

введения тиминтетразола в разовой дозе 1 мг/100 г массы

1-4 – на 3, 5, 7 и 14 сутки соответственно

исходная гистограмма

после окончания введений веществ

сроки наблюдений от ослаблении резистентности клеток крови свидетельствует

смещение кривых процесса гемолиза влево по сравнению с фоновым положением.

Анализ как эритрограмм, так и кривых кинетики гемолиза указывает на то, что

время контакта эритроцитов с соляной кислотой до начала их разрушения

заметно сокращалось. На усиление интенсивности лизиса эритроцитов указывает

также тот факт, что к 4.5 минутам у интактных крыс под влиянием гемолитика

разрушалось лишь 17%, тогда как уже после первого введения исследуемого

соединения этот показатель возрос до 33% (таблица 5).

Однако следует обратить внимание на то, что в этих условиях , при

снижении резистентности эритроцитов, общее время лизиса могло несколько

удлиниться с 7,5 до 8 минут, что по-видимому, означало появление в

периферическом русле некоторого количества более стойких клеток. Такое

явление может быть результатом компенсаторного усиления активности костного

мозга, обусловленое влиянием продуктов лизиса эритроцитов [83].

2.3. Обсуждение результатов

Результаты проведенных исследований показали, что изучаемые

производные пиримидиновых оснований оказали существенное влияние на

функциональное состояние клеточных элементов крови крыс. Анализ кривых

кинетики кислотного гемолиза и эритрограмм позволил определить влияние

пиримидиновых соединений на характер распределения эритроциов по степени их

устойчивости, а также на начало, интенсивность и завершение процесса их

разрушения под действием повреждающего агента. Сравнительный анализ

результатов исследования показал, что цитозин, цианоцитозин, а также

тетразольные производные цитозина и тимина способны различным образом

модулировать матричные свойства эритроцитов крови.

По схеме эксперимента мы остановились на дробном введении исследуемых

веществ. Это обусловлено стремлением приблизить действие данных соединений

к условиям длительного воздействия химических веществ на организм, как в

промышленном производстве, так и при применении многих лекарственных

препаратов.

Исследование цитозина не обнаружило заметного влияния на исходную

способность эритроцитов противостоять действию гемолитика. Во все сроки

наблюдения интенсивность разрушения красных клеток крови под действием

соляной кислоты и общая продолжительность лизиса мало различались с

первоначальными характеристиками и почти полностью совпадали с таковыми у

контрольной группы животных. Включение в молекулу пиримидинового основания

цианогруппы значительно увеличило его активность, выразившуюся в достаточно

закономерном усилении резистентности эритроцитов. Следует заметить, что

аналогичные данные были получены в отношении тимина, у которого при слабой

собственной активности было отмечено повышение протекторных свойств в

случае присоединения к молекуле цианового радикала [76].

Совершенно иную способность изменять функциональное состояние

эритроцитов обнаружили пиримидиновые соединения с включением в их структуры

тетразольного радикала. Во всех случаях цитозинтетразол и тиминтетразол

ослабляли исходную базовую устойчивость эритроцитов к повреждающим

воздействиям.

Поскольку вещества с общими носителями и разными радикалами в

структуре молекулы различаются по своим свойствам, правомерно считать, что

ответственными за изменение последних являются заместители. Полученные в

настоящей работе данные подтверждают сложившееся у специалистов

представление о зависимости эффекта действия вещества от особенностей его

химической структуры.

Таким образом, сопоставление результатов обработки данных, полученных

по производным гетероциклических соединений обнаружило способность одних

(цитозин, цианоцитозин) усиливать, а других (цитозинтетразол,

тиминтетразол) ослаблять исходную кислотную резистентность эритроцитов.

При обсуждении возможных механизмов влияния веществ необходимо

учитывать ряд моментов. Как известно, природные пиримидиновые основания

присутствуют во всех живых клетках в составе ДНК и РНК, являются

структурными компонентами нуклеиновых коферментов, что определяет их

участие во многих важных биохимических механизмах [7, 51, 55]. Это

позволяет допускать, что биологически активные соединения, получаемые на

основе их синтетических аналогов, способны влиять на клеточный метаболизм,

стимулируя или угнетая течение биологических процессов [41, 49, 53, 90].

Согласно имеющимся сведениям костно-мозговая ткань характеризуется

Страницы: 1, 2, 3, 4