Биотехнология

биофотолизе воды.

Примером может служить система хлоропласт — ферредоксин — гидрогеназа.

Ферредоксин служит промежуточным переносчиком электронов от

фотосинтетической цепи хлоропластов к добавленной гидрогеназе. Серьезной

проблемой является поддержание низкого парциального давления этих газов, с

тем чтобы не наступило ингибирование гидрогеназы. При замене ферредоксина

на флавопротеид или метилвиологен система образует только Н2. Флавопротеид

и, по некоторым данным, метилвиологен защищают гидрогеназу от ингибирования

кислородом. Разрабатываются системы с изолированным хлорофиллом, встроенным

в детергент ные мицеллы или липосомы вместе с гидрогеназой. Предложена

также система с гидрогеназой, иммобилизованной в агарозном геле, с которым

прочно связан полимерный виологен и металлопорфирин, аналог хлорофилла.

Водород получают также с применением целых клеток микроорганизмов,

стабильность которых возрастает при их иммобилизации. Высокоэффективными

продуцентами Н2 являются пурпурные фототрофные бактерии, например

Rhodopseudomonas sp., которые при иммобилизации в агарозном геле дают до

180 мкмоль Н2 за 1 ч в пересчете на 1 мг бактериохлорофилла (М. Tadashi, A.

Akira, 1983). Важное направление работ — поиск продуцентов Н2 с устойчивой

к О2 гидрогеназой.

Другим ферментом, катализирующим выделение водорода, является нитрогеназа.

У всех микроорганизмов нитрогеназа состоит из двух, компонентов, а именно

из MoFeS-протеида (молибдоферредоксина) и FeS-протеида (азоферредоксина).

Основной функцией нитрогеназы является восстановление молекулярного азота:

N2 + 8H+ + 8е- + nАТФ -> 2NH3 + Н2 + nАДФ + nфосфорная кислота

В отсутствие основного субстрата (N2) нитрогеназа катализирует

энергозависимое

восстановление Н+ с образованием Н2. Переключение фермента с одного режима

работы на другой является технологической проблемой. Один из путей решения

— получение штаммов микроорганизмов с нитрогеназой, не утилизирующей азот.

В Японии получен штамм Anabaena sp., который осуществляет биофотолиз воды в

режиме, не чувствительном к Н2, О2 и N2. Повышению эффективности

биофотолиза воды способствует чередование периодов функционирования

биообъекта как продуцента Н2 и О2 с периодами «отдыха», когда клетки

фотоассими-лируют СО2 (вводимый на этот период в среду культивирования).

Возможно комбинирование процессов получения Н2 и других ценных продуктов. В

частности, представители рода Clostridium дают органические растворители и

в то же время обладают активной гидрогеназой. Если в реакторе с культурой

Cl. saccharo-perbutylacetoniocum не создавать оттока для выделяющегося Н2,

то наблюдается ингибирование образования Н2 и эффективный синтез бутанола,

ацетона и этанола. Если водороду обеспечивают свободный отток, то наряду с

довольно активным образованием Н2 культура синтезирует лишь этанол. Этот

пример иллюстрирует возможность управления ходом биотехнологического

процесса условиями культивирования биообъекта.

Таким образом, предложены разнообразные проекты систем для получения

водорода с использованием биообъектов. Речь идет о вмешательстве человека в

процесс биоконверсии энергии с целью добиться ее возможно более полного

превращения в энергию химической связи в молекуле Н2.

Пути повышения эффективности фотосинтетических систем.

Рассчитанная теоретически эффективность фотосинтеза, т. е. коэффициент

превращения световой энергии в химическую энергию органических веществ,

близка к 15%. Фактически, однако, наиболее продуктивные культурные растения

запасают не более 1,5—2% энергии падающего света. Актуальная проблема

технологической биоэнергетики — повышение эффективности фотосинтеза у

культурных растений.

Разрабатывают следующие основные подходы к решению этой проблемы: 1)

повышение коэффициента превращения солнечной энергии до 4—5% за счет

увеличения площади листьев и их раннего формирования; 2) вмешательство в

системы регуляции фотосинтеза — сбалансированное использование

фитогормонов, трансплантация регуляторных генов; 3) увеличение скорости

роста растений за счет оптимизации водного и минерального питания, что

приведет к повышению их фотосинтетической активности; 4) увеличение числа

хлоропластов в клетке на единицу площади листа; 5) установление

оптимального соотношения между функционирующими реакционными центрами

хлорофилла и промежуточными переносчиками электронов, например,

цитохромами; 6) увеличение скорости переноса электронов между фотосистемами

I и II и эффективности сопряжения между транспортом электронов и синтезом

АТФ.

Радикальным способом максимизации эффективности фотосинтеза было бы

создание искусственных фотосистем, имитирующих основные блоки

фотосинтетического аппарата живых организмов, но внедрение подобных

преобразователей энергии, по-видимому, отделено от нас несколькими

десятилетиями.

Биотопливные элементы.

На уровне поисковых разработок находятся биотоплйвные элементы,

превращающие химическую энергию субстрата в электрическую. Примерами могут

служить топливные элементы на основе окисления метанола в муравьиную

кислоту с участием алкогольдегидрогеназы, муравьиной кислоты в CU2 с

участием формиатдегидрогеназы, глюкозы в глюконовую кислоту с участием

глюкозооксидазы. Используют также катали -тическую активность целых клеток,

например Е. coli, Вас. subtilis, Ps. aeruginosa, в реакции окисления

глюкозы.

Окисление субстрата происходит на электроде (аноде). Посредником между

субстратом и анодом является биокатализатор. Существуют два пути дальнейшей

передачи электронов на

электрод: 1) с участием медиатора и 2) непосредственный транспорт

электронов на электрод (А. И. Ярополов, И. В. Березин, 1985). Конструкция

биотопливного элемента позволяет генерировать не только электрический ток,

но и осуществлять важные химические превращения. Например, топливный

элемент с глюкозооксида-зой и p-D-фруктофуранидазой переводит сахарозу в

смесь фруктозы и глюконовой кислоты.

Ферментные электроды применяются не только в топливных элементах. Они

представляют собой основной компонент биологических датчиков — биосенсоров,

широко применяемых в химиче-

ской промышленности, медицине, при контроле за биотехнологическими

процессами, в аналитических целях и т. д. Обычно используют системы с

биокатализатором, иммобилизованным на поверхности мембранного электрода.

Например, иммобилизацией пенициллиназы на обычном рН-электроде получают

чувствительный биосенсор, регистрирующий концентрацию пенициллина.

Иммобилизация клеток Е. coli на кислородном электроде дает биосенсор для

измерения концентрации глутаминовой кислоты, а иммобилизация клеток Nitro-

somonas sp. и Nitrobacter sp. на том же электроде — биосенсор на NH4+. На

биосенсоре протекают следующие превращения: NH4+Nitrosomonas NO2

Nitrobacter NO3 Разработаны биосенсоры для быстрой регистрации концентрации

глюкозы в крови больного, что особенно важно при диагностике диабета.

3. Биотехнология и медицина

Нет такого экспериментального подхода или исследовательского направления в

биотехнологии, которые бы не получили применения в медицине. Вот почему

столь многообразны связи между биотехнологией и самой гуманной из всех

наук. Здесь мы остановимся лишь на основных моментах.

Антибиотики.

Антибиотики — это специфические продукты жизнедеятельности, обладающие

высокой физиологической активностью по отношению к определенным группам

микроорганизмов и к злокачественным опухолям, избирательно задерживающих их

рост или полностью подавляющих развитие (Н. С. Егоров, 1979). Далеко не все

из этих соединений, число которых приближается к 5000, допущены для

применения в медицине. К важнейшим антибиотикам терапевтического назначения

принадлежат следующие их классы (табл. 2).

Приведенные классы антибиотиков не исчерпывают их многообразия, список их

пополняется с каждым годом. Причины неослабевающего внимания к поиску новых

антибиотиков, как видно из табл. 10, связаны с токсичностью существующих

антибиотиков, аллергическими реакциями, вызываемыми ими, нарастанием

устойчивости патогенных микроорганизмов к применяемым препаратам и, помимо

этого, с необходимостью изыскания средств борьбы с возбудителями, против

которых недостаточно эффективны известные ныне антибиотики. Основные пути

поиска включают:

1. Испытание новых продуцентов. Так, с начала 80-х годов исследуют

миксобактерии, продуцирующие большое количество антимикробных агентов (Н.

Thierbach, N. Reichenbach, 1981).

2. Химическая модификация антибиотиков. Противомикроб-ные макролиды

токсичны для человека. Например, гептаен амфо-терицин В, используемый по

жизненным показаниям при тяжелых микозах, вызывает необратимые поражения

почек. Получены метиловые эфиры амфотерицина, менее токсичные и

сохраняющие противогрибковую активность. При модификации пенициллинов и

цефалоспоринов используют иммобилизованные ферменты.

Таблица 2. Важнейшие классы антибиотиков терапевтического назначения

(по И Г.. Егорову, 1979; Д.Ланчини, Ф Паренти, 1985)

|Класс |Типичные |Продуценты |На кого |Механизм |Трудности |

| |антибиотики | |действует |действии |терапевтическ|

| | | | | |ого |

| | | | | |применения |

|?-Лактамные|Пенициллины,|Грибы |Грамположител|Нарушение |Аллергические|

| |це-фалоспори|родов |ь-ные и |синтеза |реакции |

| |ны |Реnicillium,|грамотрицател|клеточной | |

| | |Cephalosporu|ьные |стенки | |

| | |m |бактерии | | |

|Аминогликоз|Стрептомицин|Актиномицеты|В основном |Необратимое |Токсическое |

|идные |, |рода |грамотрицател|подавление |действие на |

| |гентамицин, |Streptomyces|ьные |синтеза |слуховой нерв|

| |канамицин, |, бактерии |бактерии |белка |и почки |

| |тобрамицин, |родов | | | |

| |амикацин |Micromonospo| | | |

| | |ra. Bacillus| | | |

| | | | | | |

|Тетрациклин|Одноименные |Актиномицеты|Грамположител|Обратимое |Распространен|

|ы |антибиотики |рода |ьные и |подавление |ие устойчивых|

| | |Streptomyces|грамотрицател|синтеза |штаммов |

| | | |ьные |белка | |

| | | |бактерии, | | |

| | | |риккетсии, | | |

| | | |хламидии, | | |

| | | |простейшие | | |

|Макролиды |Антибактериа|Актиномицеты|Грамположител|То же |Токсичность |

| |льные: |рода |ьные бактерии|Нарушение | |

| |эритромицин |Streptomyces|Грибы, |плазматическ| |

| |Противогрибк|То же |некоторые |ой | |

| |овые и | |простейшие |мембраны | |

| |антипротозой| | | | |

| |ные: полиены| | | | |

| | | | | | |

|Полипептидн|Полимиксины,|Различные |В основном |Механизм |Высокая |

|ые и |грамицидины,|микро-органи|грамотрицател|действия |токсичность |

|депсипептид|бацитрацины |змы |ьные |различен | |

|ные | | |бактерии | | |

3. Мутасинтез. Применяют мутантные штаммы, у которых блокирован синтез

отдельных фрагментов молекулы антибиотика. В среду культивирования

вносят аналоги этих фрагментов. Микроорганизм использует эти аналоги для

биосинтеза, в результате чего получают модифицированный антибиотик.

4. Клеточная инженерия. Получают гибридные антибиотики, например, с новыми

комбинациями агликона и Сахаров.

5. Генетическая инженерия — введение в геном микроорганизма информации о

ферменте, необходимом для модификации продуцируемого антибиотика,

например его метилирования при помощи метилаз.

Важной задачей является повышение эффективности биосинтеза известных

антибиотиков. Значительных результатов удалось добиться за десятилетия

селекции штаммов-продуцентов с применением индуцированного мутагенеза и

ступенчатого отбора. Например, продуктивность штаммов Penicillium по

синтезу пенициллина увеличена в 300—350 раз. Определенные перспективы

открываются в связи с возможностью клонирования генов «узких мест»

биосинтеза антибиотика или в случае, если все биосинтетические ферменты

кодируются единым опероном.

Многообещающим подходом служит инкапсулирование антибиотиков, в частности

их включение в лигюсомы, что позволяет прицельно доставлять препарат только

к определенным органам и тканям, повышает его эффективность и снижает

побочное действие. Этот подход применим и для других лекарственных

препаратов. Например, кала-азар, болезнь, вызываемая лейгшма-нией,

поддается лечению препаратами сурьмы. Однако лечебная доза этих препаратов

токсична для человека. В составе липосом препараты сурьмы избирательно

доставляются к органам, пораженным лейшманией, — селезенке и печени.

Вместо антибиотика в организм человека может вводиться его продуцент,

антагонист возбудителя заболевания. Этот подход берет начало с работ И.

И.Мечникова о подавлении гнилостной микрофлоры в толстом кишечнике человека

посредством молочнокислых бактерий. Важную роль в возникновении кариеса

зубов, по-видимому, играет обитающая во рту бактерия Streptococcus mutans,

которая выделяет кислоты, разрушающие зубную эмаль и дентин. Получен мутант

Strept. mutans, который при введении в ротовую полость почти не образует

коррозивных кислот, вытесняет дикий патогенный штамм и выделяет летальный

для него белковый продукт.

Гормоны.

Биотехнология предоставляет медицине новые пути получения ценных

гормональных препаратов. Особенно большие сдвиги произошли в последние годы

в направлении синтеза пеп-тидных гормонов.

Раньше гормоны получали из органов и тканей животных и человека (крови

доноров, удаленных при операциях органов, трупного материала). Требовалось

много материала для получения небольшого количества продукта. Так,

человеческий гормон роста (соматотропин) получали из гипофиза человека,

каждый гипофиз содержит его не более 4 мг. В то же время для лечения одного

ребенка, страдающего карликовостью, требуется около 7 мг соматотропина в

неделю; курс лечения должен продолжаться несколько лет. С применением

генноинже-нерного штамма Е. coli в настоящее время получают до 100 мг

гормона роста на 1 л среды культивирования. Открываются перспективы борьбы

не только с карликовостью, но и с низкорос-лостью — более слабой степенью

дефицита соматотропина. Соматотропин способствует заживлению ран и ожогов,

наряду с каль-цитонином (гормоном щитовидной железы) регулирует обмен Са2+

в костной ткани.

Инсулин, пептидный гормон островков Лангерганса поджелудочной железы,

представляет основное средство лечения при сахарном диабете. Эта болезнь

вызвана дефицитом инсулина и проявляется повышением уровня глюкозы в крови.

До недавнего времени инсулин получали из поджелудочной железы быка и

свиньи. Препарат отличался от человеческого инсулина 1—3 аминокислотными

заменами, так что возникала угроза аллергических реакций, особенно у детей.

Широкомасштабное терапевтическое применение инсулина сдерживалось его

высокой стоимостью и ограниченностью ресурсов. Путем химической модификации

инсулин из животных удалось сделать неотличимым от человеческого, но это

означало дополнительное удорожание продукта.

Компания Eli Lilly с 1982 г. производит генноинженерный инсулин на основе

раздельного синтеза Е. coli его А- и В-цепей. Стоимость продукта

значительно снизилась, получаемый инсулин идентичен человеческому. С 1980

г. в печати имеются сообщения о клонировании у Е. сой гена проинсулина —

предшественника гормона, переходящего в зрелую форму при ограниченном

протеолизе.

К лечению диабета приложена также технология инкапсули-рования: клетки

поджелудочной железы в капсуле, введенные однократно в организм больного,

продуцируют инсулин в течение года.

Компания Integrated Genetics приступила к выпуску фолли-кулостимулирующего

и лютенизирующего гормонов. Эти пептиды составлены из двух субъединиц. На

повестке дня вопрос о промышленном синтезе олигопептидных гормонов нервной

системы — энкефалинов, построенных из 5 аминокислотных остатков, и

эндорфинов, аналогов морфина. При рациональном применении эти пептиды

снимают болевые ощущения, создают хорошее

настроение, повышают работоспособность, концентрируют внимание, улучшают

память, приводят в порядок режим сна и бодрствования. Примером успешного

применения методов генетической инженерии может служить синтез р-эндорфина

по технологии гибридных белков, описанной выше для другого пептидного

гормона, соматостатина.

Значителен вклад биотехнологии и в промышленное производство непептидных

гормонов, в первую очередь стероидов. Методы микробиологической

трансформации позволили резко сократить число этапов химического синтеза

кортизона, гормона надпочечников, применяемого для лечения ревматоидного

артрита. При производстве стероидных гормонов широко используют

иммобилизованные микробные клетки, например Arthrobacter globiformis, для

синтеза преднизолона из гидрокортизона. Имеются разработки по получению

гормона щитовидной железы тироксина из микроводорослей.

Интерфероны, интерлейкины, факторы крови.

Интерфероны выделяются клетками человека и животных в ответ на инфици-

рование вирусами. Они обладают антивирусной активностью. Механизм действия

интерферонов до конца не выяснен. Предполагается, в частности, что

Интерфероны препятствуют проникновению вирусных частиц в клетку.

Интерфероны стимулируют деятельность иммунной системы и препятствуют

размножению клеток раковых опухолей. Все аспекты действия интерферонов

важны с точки зрения их терапевтического применения.

Различают ?-, ?-, ?- и (-интерфероны, образуемые соответственно

лейкоцитами, фибробластами соединительной ткани, Т-лимфоцитами и

эпителиальными клетками. Наибольшее значение имеют первые три группы.

Интерфероны состоят из 146—166 аминокислотных остатков, ? - и ?-интерфероны

связаны с остатками Сахаров (гликозилированы). До введения методов

генетической инженерии интерфероны получали из донорской крови — до 1 мкг

неочищенного интерферона из 1 л крови, т. е. примерно одну дозу для

инъекции.

В настоящее время ?-, ?- и ?-интерфероны успешно получают с применением

генноинженерных штаммов Е. coli, дрожжей, культивируемых клеток насекомых

(Drosophil?) и млекопитающих. Генно-инженерные интерфероны могут быть

очищены с использованием моноклональных антител. В случае у- и р-

интерферонов предпочтительно применение эукариотических продуцентов, так

как прокариоты не гликозилируют белки. Некоторые фирмы, например Bioferon

(ФРГ), используют не генноинженерные мутанты, а культивируемые in vitro

фибропласты человека.

Интерфероны используются для лечения болезней, вызываемых вирусами герпеса,

бешенства, гепатитов, цитомегаловиру-сом, вирусом, вызывающим опасное

поражение сердца, а также для профилактики вирусных инфекций. Вдыхание

аэрозоля интерферонов позволяет предупредить развитие острых респираторных

заболеваний. Несколько курьезной проблемой является то что интерфероны, в

частности ?-интерфероны, сами могут вызывать у пациентов простудные

симптомы (насморк, повышение температуры и т.д.). Проблема побочного

действия стоит особенно остро при длительном терапевтическом применении

интерферонов, необходимом для лечения злокачественных опухолей.

Интерфероны оказывают лечебное воздействие на организм больных раком груди,

кожи, гортани, легких, мозга, рассеянной миеломе и саркоме Капоци — два

последних заболевания характерны для лиц, страдающих приобретенными

иммунодефицитами (см. ниже). Интерфероны полезны также при лечении

рассеянного склероза.

Методы генетической инженерии позволяют получать модифицированные

Интерфероны. Антивирусная активность интерферонов варьирует при

аминокислотных заменах (J. Werenne, 1983). Американская компания Cetus

Corporation производит ?-интер-ферон, в аминокислотной последовательности

Страницы: 1, 2, 3, 4