Современная генетика

transpozi?ie a genelor, lui i se atribuie un mare rol оn evolu?ia

aparatului genetic, precum ?i оn reglarea ac?iunii genelor оn cursul

ontogenezei. Pe la mijlocul deceniului al optulea colaboratorii ?tiin?ifici

оn frunte cu G. Gheorghiev (IBM A? URSS) ?i D. Hognes (SUA) au constatat c?

printre genele ce func?ioneaz? activ ale musculi?ei drosofila multe n-au un

loc stabil ?i sunt plasate оn fragmente ale tuturor cromozomilor, adic?

sunt multiple.

Cel mai uimitor a fost, оns?, faptul c? aceea?i gen? la diferite

musculi?e se afl? localizat? la cromozomi оn mod diferit. La mu?tele de

diferite linii deosebirile erau foarte mari, la rude s-au constatat mai

multe coinciden?e, dar, totu?i, la aproximativ o treime din ele genele erau

dislocate absolut diferit.

A devenit limpede c? unele gene n-au dislocare definit? оn cromozom - la

diferi?i indivizi de drosofil? de aceea?i specie ele pot ocupa diferite

pozi?ii.

Оn genomul drosofilei pвn? оn prezent au fost studiate aproximativ 20 de

familii de gene mobile cвte 100-150 copii оn fiecare familie. Num?rul total

al acestor gene este de aproape 1000, ele formвnd aproximativ 5% din

оntregul material genetic. Genele mobile sunt alc?tuite de obicei din 5-10

mii de perechi de nucleotide, dintre care repet?rilor terminale le revin

cвte 300-600 perechi.

S-a constatat c? оn repet?rile acestor gene exist? toate elementele de

conducere: promotorul, terminatorul ?i amplificatorul. Deoarece aparatul de

conducere este dislocat la ambele poluri ale genelor, el poate pune оn

func?iune nu numai elementele mobile, dar ?i genele din vecin?tate cu el.

E fireasc? оntrebarea: de ce avem nevoie de elementele genetice mobile?

Elementele mobile ale genomului sunt purt?tori ai informa?iei referitor

la fermen?i de care au nevoie chiar ele pentru a se disloca ?i a se

оnmul?i.

Majoritatea savan?ilor consider? c? genele mobile sunt ADN «egoist» sau

«parazi?i geneticii», a c?ror sarcin? principal? este autoreproducerea.

Ele toate prezint? un balast pentru celul?: dac? din genom va fi scos vre-

unul din elementele mobile, aceasta nu va influen?a activitatea vital? a

celulei. Оn asemenea caz se isc? оntrebarea: cum influen?eaz? disloc?rile

elementelor mobile asupra vie?ii celulei? Genele mobile оntr-un loc al

genomului exercit? o ac?iune puternic? asupra genelor vecine. Efectul poate

fi diferit: dac? aceste elemente nimeresc оn partea codificatoare a genei

structurale, se modific? оndat? textul оnregistrat pe care оl poart?

aceast? gen?. ?i оnc? o situa?ie tipic?: elementul mobil se insereaz?

al?turi de gen?. Ca urmare se modific? intensitatea func?ion?rii acesteia.

Оn special se poate оncepe o transcrip?ie intens? a genei, care a ni-merit

sub ac?iunea promotorului sau amplificatorului, dislocat la polurile

elementului mobil, iar sub ac?iunea unor asemenea explozii de variabilitate

molecular? se asigur? o adaptare mai bun? a organismelor la condi?iile

schimb?toare ale mediului. ?i cum s? nu ne amintim aici proverbul antic: оn

natur? nimic nu este de prisos!

10.2 Direc?iile principale ale ingineriei genetice

Ingineria genetic? se nume?te, de obicei, genetic? celuar? ?i molecular?

aplicat?, care elaboreaz? metode de interven?ie experimental?, ce permit

restructurarea conform unui plan trasat оn prealabil a genomului

organismelor, modificвnd оn el informa?ia genetic?.

Conform opiniei cunoscutului geneticiian S. Gher?enzon, la ingineria

genic? pot fi referite urm?toarele opera?ii:

- sinteza genelor оn afara organismelor;

- extragerea din celule a unor gene, cromozomi sau nuclee;

- restructurarea dirijat? a structurilor extrase;

- copierea ?i multiplicarea genelor sau a structurilor sintetizate ?i

separate;

- transferul ?i inserarea unor asemenea gene sau structuri genetice оn

genomul ce urmeaz? s? fie modificat;

- оmbinarea experimental? a diferitelor genomuri оntr-o singur? celul?.

A?a dar este vorba de metode de manipulare la nivel molecular, cromozomic

sau celular cu scopul de a modifica programul genetic оn direc?ia dorit?.

Ingineria genic? о?i propune s? introduc? realiz?rile ei revolu?ionare

оntr-o serie de ramuri ale economiei na?ionale. Se a?teapt? ca ea s?

contribuie la asigurarea cu asemenea substan?e biologice active precum sunt

aminoacizii, hormonii, vitaminele, antibioticele ?. a. Exist? mari speran?e

de a m?ri pe aceast? cale diferitele vaccinuri, care sunt utilizate оn

profilaxia bolilor infec?ioase ale oamenilor ?i animalelor, de a lichida

rezisten?a diferi?ilor microbi patogeni la antibiotice ?. a. m. d.

Mari perspective se deschid оn fa?a ingineriei genetice оn fitotehnie. Se

?tie c? soiurile mai roditoare de grвu, orez, porumb, sorg ?i de celelalte

culturi cerealiere, care au marcat epoca «revolu?iei verzi» оntr-un rвnd de

??ri ale lumii, au nevoie de cantit??i enorme de оngr???minte minerale, ?i

оn primul rвnd de cele azotice, de producerea c?rora depinde оn mare m?sur?

economia acestor ??ri.

Totodat? noi tr?im la fundul unui ocean de aer, care con?ine 79 % de

azot. Crearea unor soiuri de plante capabile s? capteze azotul atmosferic

ar face de prisos producerea lui pe cale industrial?, fapt ce ar elibera

mijloace colosale pentru alte nevoi ale ??rii.

Un interes la fel de mare оl prezint? ?i proiectele de creare a unor

specii de alge, care ar avea capacitatea de a absorbi selectiv cationii

diferitelor s?ruri pentru a face potabil? apa marin?.

A face potabil? apa marin? este una dintre problemele cele mai arz?toare,

care se afl? оn centrul aten?iei unui comitet special al ONU. Cu fiece an

pe planeta noastr? se resimte tot mai mult deficitul de ap? potabil?.

Pentru a ne imagina mai bine acest deficit, vom aduce urm?torul exemplu: оn

lacul Baical sunt concentrate peste 20% din rezervele de ap? potabil? din

lume. ?i peste 80% din cele ale fostei URSS. Doar no?iunea de «ap?

potabil?» include to?i ghe?arii, toate rвurile, apele subterane.

Unele din proiectele ingineriei genice enumerate mai sus par a fi

rezolvabile chiar ast?zi, altele ?in de domeniul fantasticii, dar progresul

tehnico-?tiin?ific, precum s-a dovedit de nenum?rate ori, apropie de

realizare chiar cele mai fantastice planuri.

Direc?iile ?tiin?ifice fundamentale, care au fost elaborate relativ nu

demult оn acest domeniu de cercet?tori, sunt ingineria celular?, ingineria

cromozomic? ?i ingineria genic?. Ele pot fi, pe drept cuvвnt, numite c?i

magistrale ale ingineriei genetice.

Ingineria celular? are scopul de a ob?ine unele plante оntregi din

protopla?ti izola?i, sau, precum le numesc savan?ii, «plante din eprubet?»;

cultivarea celulelor vegetale оntr-un mediu nutritiv artificial, pentru

ob?inerea оn mod accelerat a unui volum mare de mas? biologic? din care se

vor extrage ulterior variate substan?e biologice active; cultivarea оn

comun a protopla?tilor («celulelor goale») pentru a se ob?ine a?a-zi?ii

hibrizi asexua?i sau somatici, care оmbin? caractere de valoare ale

diferitelor specii, genuri ?i chiar familii de plante.

Ingineria celular?, fiind aplicat? la animale, ar permite utilizarea

celulelor sexuale ?i somatice (corporale), precum ?i a zigo?ilor (ovulii

fecunda?i) ?i germenilor precoci ai unor reproduc?tori ce se disting prin

indicii lor geneticii, pentru accelerarea procesului de ob?inere a unor

rase de mare randament.

Ingineria cromozomic? о?i propune transferarea unor cromozomi de la unele

specii de organisme la altele pentru a le transmite noi tr?s?turi utile.

Aceasta se mai ocup? ?i de metodele de ob?inere a hibrizilor dep?rta?i

fecunzi de plante ?i chiar de ob?inerea unor specii noi prin m?rirea оn

celulele lor a garniturilor de cromozomi.

Ingineria genic? este calea magistral?, prospectul central al ingineriei

genetice, deoarece anume pe aceast? cale au fost ob?inute rezultatele cele

mai nea?teptate, cu privire la reconstruirea genomilor din celulele

microorganismelor, plantelor ?i animalelor.

Prin metoda ingineriei genice se sintetizeaz? gene noi, se realizeaz?

transmutarea ?i inserarea lor оn genomurile organismelor, se ob?ine оn ele

expresia genelor str?ine. Ingineria genic? va face posibil? ?i vindecarea

oamenilor de numeroase defecte ereditare.

10.3 Separarea ?i sinteza artificial? a genelor

Pentru a оnzestra un organism ne cale artificial? cu noi propriet??i,

trebuie s? introducem оn el o nou? gen? sau un grup de gene, ce ar

func?iona acolo, adic? ar produce proteine. Gena necesar? se ob?ine «оn

form? pur?» prin cвteva metode. Cel mai des ea este separat? direct din

ADN.

Aceast? procedur? se realizeaz? cu ajutorul a dou? opera?ii de baz?,

care pot fi denumite simplu «sec?ionare» ?i «suturare». Rolul de

instrumente оl joac? ni?te proteine speciale - fermen?ii, care-s

catalizatori biologici ai diferitelor procese ?i reac?ii, ce se produc cu

moleculele оn celule. Exist? un grup de fermen?i, care au o ac?iune

specific? asupra ADN-ului ?i se utilizeaz? pe larg оn ingineria genetic?.

Ace?tia sunt: restrictazele, ADN-ligazele, revertazele, transferazele

terminale ?. a. m. d. Cel mai des sunt utilizate оn acest scop

restrictazele ?i ligazele. Restrictazele func?ioneaz? ca ni?te «foarfece»

moleculare, iar ligazele, dimpotriv?, unesc оntr-un tot оntreg moleculele

t?iate de ADN.

Restrictazele, ac?ionвnd asupra catenei de ADN, recunosc o anumit?

succesiune de nucleotide. Оn fig. 21 este prezentat schematic sectorul

molecular ADN cu dou? catene. Restrictaza, numit? Hind II, «recunoa?te»

succesiunea compus? din ?ase nucleotide GTC, GAC, pe care o taie exact la

mijloc.

Restrictaza cu denumirea conven?ional? RI «recunoa?te» o alt? succesiune

a nucleotidelor GAA TTC ?i «taie» ADN-ul оn acest loc asimetric, «оn

trepte». La fel de asimetric, dar оn alt? direc?ie ADN-ul este t?iat de

restrictaza PstI ?. a. m. d. Toate aceste fragmente t?iate pot fi suturate

din nou оntr-un tot оntreg de fermentul ligaza. Оn prezent cunoa?tem peste

patru sute de restrictaze ?i lista lor se completeaz? mereu. Cu ajutorul

fermen?ilor polii fragmentelor ADN pot fi lungi?i, din ei pot fi

оndep?rtate sectoare aparte, ADN-ul poate fi t?iat exact оn locul necesar,

adic? genele pot fi separate, croite ?i recroite dup? voia

experimentatorului, ceea ce este foarte important pentru construirea

moleculelor de ADN hibride sau recombinante.

Deoarece savan?ii dispun de un num?r limitat de gene pentru ob?inerea

moleculelor recombinante, ei utilizeaz? оn calitate de surse de gene, оn

primul rоnd, ADN-ul total, fragmentat sau t?iat оn segmente aparte de

fermen?ii restric?iei. Aceast? metod? a fost numit? metoda fragment?rii.

Datorit? ac?iunii restrictazelor ADN-ul se scindeaz? оn numeroase

fragmente, unele dintre ele con?inвnd gene.

Popula?ia acestor molecule de ADN este multiplicat? оn sistemul

bacterial, dup? care se selecteaz? genele necesare. La selectare este

folosit de obicei ca prob?-test ARNi radioactiv, sau copia ADNc, care

corespunde acestei gene. Aceast? metod? permite separarea atвt a genelor

ce se repet?, cвt ?i a genelor unice. Dificult??ile legate de selectarea

genelor unice se datoresc concentr?rii lor mici оn ADN-ul total. Astfel,

bun?oar?, printre fragmentele de ADN total un fragment de gen? unic? revine

la un milion de toate celelalte fragmente.

Оn prezent din ADN-ul total al unei serii de obiecte au fost separate

genele structurale. S. Cohen ?i D. Hogness оmpreun? cu colaboratorii lor au

separat pentru prima oar? din ADN-ul ariciului-de-mare ?i drosofilii cloni,

care con?in gene histonice ?i ribozomice.

La Institutul de biologie molecular? al A? al fosteо URSS (laboratorul

lui G. Gheorghiev) оn colaborare cu Institutul de energie atomic? I. V.

Curceatov (V. Gvozdev ?i colaboratorii s?i) s-a ob?inut prin intermediul

acestei metode o serie de gene structurale din ADN-ul drosofilei. Deoarece

acest obiect a fost bine studiat din punct de vedere genetic, prezint?

interes determinarea direct? a localiz?rii ?i func?iei posibile оn cromozom

a genelor separate.

Savan?ii au оnv??at nu numai s? separe din ADN gene ale diferitelor

organisme, dar ?i s? sintetizeze gene artificiale. Prima gen? artificial?,

care a оnceput s? func?ioneze, a fost sintetizat? de un grup de

colaboratori ai Institutului tehnologic din Massaciusets (SUA) оn frunte cu

X. Khorana - laureat al Premiului Nobel. Acasta a fost gena ARNt al

tirozinei.

Оn anul 1970 la Simpoziumul interna?ional de chimie ai compu?ilor

naturali din ora?ul Riga X. Khorana a f?cut o comunicare cu privire la

sintetizarea p?r?ii structurale a unei alte gene - ARNt al alaninei.

Acestei gene оi lipseau, оns?, оnc? cвteva p?r?i componente, ?i de aceea n-

a putut func?iona оn celule str?ine. Tot atunci colaboratorii laboratorului

lui X. Khorana au reu?it s? sintetizeze un segment din 85 de perechi de

nucleotide, care corespundea succesiunii ini?iale a ARNt-ului tirozinei.

Dar ?i aceast? gen? ca ?i cea a ARNt-ului alaninei s-a dovedit biologic

inactiv?.

Mai curвnd s-a clarificat una din cauzele e?ecului - оn celul? se

sintetizeaz? la оnceput ARNt-ul precursor compus din 126 de nucleotide.

Dup? aceasta un ferment special taie o parte din molecula precursoare ?i

abia atunci se transform? оn molecul? lucr?toare. A fost determinat?

succesiunea acestei precursoare ?i sintetizat segmentul respectiv de ADN

compus din 126 perechi de nucleotide. Dar nici Aceast? gen? nu era activ?

din punct de vedere biologic.

?i aici a devenit limpede c? gena artificial? nu va putea func?iona оn

celul?, dac? nu va fi оnzestrat? cu sectoare de reglare - cu promotorul

care pune оn func?iune sinteza ARNt-ului ?i terminatorul care pune cap?t

sintezei. A fost nevoie de metode speciale pentru a determina succesiunea

acestor sectoare de reglare. S-a constatat c? promotorul con?ine 59 perechi

de nucleotide, iar terminatorul - 21 de perechi. A fost sintetizat? o gen?

complicat? cu promotor ?i terminator. Ba chiar mai mult, pentru ca celula

s? nu recunoasc? оn gen? un str?in, s-a decis c? ea s? nu se plimbe la

voie, c? ea trebuie suturat? оn ADN-ul celulei. Оn acest scop la ambele

poluri ale genei sintetizate au fost unite capete «lipicoase» cu un singur

filament. Tocmai aceste poluri se formeaz? оn ADN, cвnd fermentul

restrictaza оl taie оn buc??i.

Dac? se va ac?iona asupra ADN-ului cu restrictaza, iar apoi se va ad?uga

gena sintetic?, capetele ADN-ului ?i ale genei se vor lipi unul de altul ?i

gena se va оncorpora оn ADN. R?mвne doar de suturat jonc?iunile cu

fermentul ligaza. Savan?ii au procedat tocmai a?a. ?i... iar au e?uat.

Bacteria E. coli n-a receptat gena str?in?. Cercet?torii erau aproape

dispera?i. ?i atunci au оncercat s? sutureze gena nu оn ADN-ul

colibacilului, ci оn ADN-ul unuia din virusurile, care se оnmul?esc оn

aceast? bacterie. De data aceasta savan?ii au lucrat bucurвndu-se de

succes: dup? ce celula colibacilului a fost infectat? cu virusul, оn gena

c?ruia a fost оncorporat? gena artificial?, bacteria a оnceput a sintetiza

ARNt-ul codificat оn aceast? gen?.

A?a dar, a оnceput a func?iona prima gen? sintetic?.

De atunci familia genelor sintetice artificiale cre?te mereu. Оndat? ce a

fost descoperit fenomenul reverstran-scrip?iei, adic? procesul de

transferare a informa?iei genetice de la ARN la ADN, savan?ii au оnceput s?

vorbeasc? despre posibilitatea unei noi c?i, fermentative, de sinteza

genei.

Pentru aceast? sintez? serve?te ca matri?? ARN-ul, care se elaboreaz? оn

celul? ?i prezint?, precum ?tim, o copie complementar? a unui fragment

anumit al ADN-ului. Dup? ce am separat acest ARNi, putem ob?ine prin

transcriere invers? o molecul? de ADN complementar? ei. Probabil c? ea va

fi o copie fidel? a genei ini?iale.

Primele experien?e reu?ite de sintetizare fermentativ? a genei au fost

efectuate оn laboratoarele din str?in?tate оn anul 1972.

Оn anul 1973 L. Chiseliov ?i L. Frolova, colaboratori la Institutul de

biologie molecular?, precum ?i C. Gazarean ?i V. Tarantul de la Institutul

de energie atomic? «Curceatov», dirija?i de academicianul V. A. Enghelgard,

au ob?inut partea informatic? a genei, globina, utilizвnd matri?a ARNi-ului

globinic din celulele porumbelului.

Оn acest timp оn cadrul proectului «revertaza» a activat ?i un alt grup

de savan?i - V. Cavzan ?i A. Rвndici de la Institutul de biologie

molecular? ?i genetic? al A? Ucrainene, care au reu?it ?i ei s? sintetizeze

gena globin?, utilizвnd drept matri?? ARNi-ul globinic al iepurelui de

cas?, nu al porumbelului.

Оn anul 1979 s-au soldat cu succes lucr?rile de sintetizare a genelor de

bradichinin?, datorit? eforturilor comune ale savan?ilor de la Institutele

de genetic? general? ?i de chimie bioorganic? ?i de anghiotenzin? - de

c?tre savan?ii Institutului de citologie ?i genetic? al A? a Federa?iei

Ruse.

Оn anul 1981 la Institutul de biologie molecular? un grup de colaboratori

(S. Deev, N. Barbacari, O. Poleanovschii ?. a.) au sintetizat ?i au

transferat оntr-o celul? bacterian? o gen? care codifica una din catenele

u?oare ale imunoglobulinei. Mai tвrziu оn ?ara noastr?, cвt ?i оn

laboratoarele str?ine au fost sintetizate multe gene: a somatostatinei,

somatotropinei, insulinei, interferonului ?. a. care ?i-au g?sit aplicare

larg? оn practic?.

10.4 Clonarea genelor

Genele separate din alte organisme sau sintetizate artificial pe cale

chimic?. fiind transferate оn celule noi, nu sunt оn stare s? se reproduc?

nici s? se transmit? descenden?ei acestor celule. Acest lucru se poate

ob?ine, dac? ele se vor introduce оn prealabil оn componen?a structurii

genetice, care are un aparat propriu de reproducere. Оn ingineria genetic?

aceast? structur? este cu adev?rat figura central? оn toate manipul?rile

ingineriei genice. poart? numele de vector, sau «transportor».

Vectorul este o molecul? de ADN capabil? s? transfere оn celul? o gen?

str?in? ?i s? asigure acolo оnmul?irea ei, sintetizarea produsului proteic

?i оncorporarea оn cromozom.

De cele mai multe ori оn calitate de vector sunt utilizate plazmidele

bacteriilor, virusurile bacteriilor (bacteriofagii) ?i virusurile

animalelor, precum ?i cosmidele, care con?in elemente genetice ale

plazmidelor ?i ale bacteriofagilor.

Molecula-vector trebuie s? aib? capacitatea de replicare autonom? ?i s?

con?in? anumite gene de semnalare (marcatori), bun?oar? gene de rezisten??

la antibiotice, care permit descoperirea ?i identificarea celulelor

modificate.

Plazmidele sunt larg r?spвndite оn lumea bacteriilor. Sunt, precum s-a

notat mai sus, mici molecule inelare de ADN, care se afl? оn celulele

bacteriale. Poate fi o molecul? sau cвteva. Plazmida con?ine genele

necesare pentru reproducerea ADN-ului ?i genele rezistente la antibiotice,

de exemplu la ampicilin? ?i tetraciclin?, precum vedem оn fig. 22.

Оn interiorul acestor gene se afl? fragmente pe care le recunosc

restrictazele. Asemenea fragmente exist? bineоn?eles ?i оn alte locuri ale

plazmidei, dar cele din interiorul genelor de rezisten?? sunt deosebit de

importante, deoarece anume acolo se insereaz? ADN-ul str?in. Gena este

v?t?mat? ?i bacteria care con?ine o astfel de molecul? hibrid? devine

incapabil? s? opun? rezisten?? ac?iunii antibioticicor. Aceast?

particularitate permite selectarea pentru оnmul?irea continu? numai a

bacteriilor care con?in molecula hibrid? sau molecula recombinant? de ADN.

A?a dar, moleculele recombinate con?in gene care trebuie оnmul?ite ?i

vectorii cu ajutorul c?rora se realizeaz? acest proces.

To?i vectorii plazmidici utiliza?i оn ingineria genetic? sunt crea?i pe

cale artificial? prin reunirea unor p?r?i aparte a diferitelor plazmide

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33